[Ocean Insight]吸光度線性有多重要？

資料來源:https://www.oceaninsight.com/blog/how-important-is-absorbance-linearity/

作者:Rob Morris

宏惠光電是Ocean Insight 代理商

 

光譜儀中的高性能吸光度線性度僅限於復雜且昂貴的儀器。現在，像 Ocean ST 這樣更簡單、更易於使用的光譜儀正在取得可比的測量結果。

在本應用說明中，我們評估了用於蛋白質和 DNA 測量的Ocean ST 顯微光譜儀的吸光度線性度。Ocean ST 是最近發布的光譜儀，以其出色的紫外線響應（185-650 nm）、高信噪比性能和超緊湊的尺寸（小於智能手機）而著稱。

注：Yvette Mattley 博士為本應用說明提供了測量結果。

 

背景
為什麼吸光度？吸光度測量提供有關材料化學成分的寶貴信息。入射到樣品上的光可以被傳輸、吸收或散射。透射是穿過樣品的光；遇到分子的光可以被吸收或散射。吸光度可用作鑑定物質的定性工具或用作測量溶液中分子濃度的定量工具。

吸光度是一系列應用中的一項重要技術，尤其是在生物醫學和生命科學領域，研究人員、開發人員和工藝工程師將吸光度技術應用於從蛋白質分析到即時診斷的挑戰。

 

吸光度線性
光譜儀測量精度的一個指標是其吸光度線性度。這在比爾定律中有所描述，其中吸收給定波長的光的溶液將在該波長處產生吸收峰，其強度隨著溶液濃度的變化而線性變化。例如，如果溶液濃度加倍，吸收峰的高度也會加倍。因此，當我們將光譜儀描述為具有 2 AU（吸光度單位）的吸光度線性度時，這表明超過 2 AU，樣品濃度和吸光度峰之間的關係就會破裂（不再是線性的）。這種故障與包括檢測器噪聲和雜散光在內的限制因素有關。

具有高吸光度線性度的光譜儀允許用戶 1) 在廣泛的濃度水平範圍內準確測量樣品，以及 2) 消除高度複雜的樣品稀釋步驟的需要，這些步驟有可能在測量過程中引入誤差。這對於需要非常高的測量精度的應用、您想要將一個實驗的結果與下一個實驗的結果進行比較或者您的樣本量有限的應用來說至關重要。 

使用 Ocean ST 測定蛋白質和 DNA 的吸光度

為了評估 Ocean ST 的吸光度線性，我們測量了牛血清白蛋白 (BSA) 和 DNA 寡核苷酸。BSA 是一種常用於生化應用的蛋白質，而寡核苷酸是合成 DNA 或 RNA，常用於包括基因檢測和醫學診斷在內的無數應用。

設備設置

我們使用 Ocean ST-UV (185-650 nm)，積分時間設置為 3.8 ms，掃描平均為 100，boxcar 寬度設置為 3。存儲暗光譜並啟用非線性校正。光譜儀和光源在測量前預熱 30 分鐘，以確保熱穩定性。

這是設置的其餘部分：

• DH-2000-S-DUV-TTL 深紫外氘和鹵鎢光源。對於這些實驗，我們只使用了氘燈。對於所有測量，鹵素燈都關閉。
• SQ1-ALL比色皿架。這是用於 1 cm 比色皿的通用比色皿支架。
• CV-Q-10 1 cm (10 mm) 光程石英比色皿。石英比色皿是 UV 測量的最佳選擇。
• QP450-1-XSR極耐日曬光纖（數量 2）。這些是帶有不銹鋼 BX 護套的 450 µm SR 光纖。

樣品製備和測量
我們測量了濃度範圍為 0.02 至 5 mg/mL 的 30 個 BSA (Sigma A2153) 和濃度範圍為 0.3 至 150 µg/mL 的 35 個寡聚 DNA (Sigma D-3159)。所有稀釋均直接在石英比色皿中完成，方法是從比色皿中取出 0.5 mL 樣品，向比色皿中加入 0.5 mL 蒸餾水，然後通過輕輕移入和移出吸頭 3 次來混合樣品。在測量過程中，石英比色皿沒有從比色皿支架上取下，有助於最大限度地減少污染物或比色皿正確對齊問題造成的潛在錯誤。

結果
BSA 的吸光度測量顯示吸光度線性為 2 AU，超出了我們對 Ocean ST 的預期（圖 1）。這具有非常積極的意義，因為 BSA 是一種典型的蛋白質，在生命科學研究和開發的許多領域都有應用。

圖 1. Ocean ST 顯微光譜儀在很寬的蛋白質濃度水平範圍內表現出卓越的吸光度線性。

DNA 寡核苷酸的 Ocean ST 測量也取得了同樣令人印象深刻的吸光度線性結果（圖 2）。這表明 Ocean ST 對寡核苷酸用戶和定制寡核苷酸生產的價值，寡核苷酸用戶是許多分子生物學研究和開發工作的起點，在定制寡核苷酸生產中，紫外-可見光譜被用作製造中的量化步驟過程。

 

圖 2. Ocean ST 顯微光譜儀展示的吸光度線性通常與更複雜、更不易接近的光譜儀相關聯。

宏惠光電是Ocean Insight 代理商