從拉曼中獲取蛋白質

重點 : 
•   厭氧菌 
•   牛膠原蛋白 
•   微生物過程

技術 : 
•   吸收率 
•   拉曼

應用 : 
•   蛋白質監測 
•   濃度驗證 
•   物種鑑定

 

在這篇應用筆記中，我們評估在分析蛋白質中使用785nm拉曼分析來補足傳統的紫外-可見光光譜技術。兩種技術都能提供貴重的分析洞察力在複雜的生物工程流程應用，包含了醫療診斷和製藥開發。

漢堡王可能不像過去一樣受歡迎，但他們的「隨心所欲」的理念已被許多其他的現代行業所採用。不喜歡餐館?那就入住適合你的偏好的Airbnb。不喜歡收看預定節目?你可以在任何時候收看任何內容的在線實況。認為藥物太通用?根據你的特定基因來設計和生產客製化治療方式。

最後一個例子在最近幾年便成了熱門話題，因為公共基因組測試以及穿戴式健康設備提供了環繞整個單一個體的前所未有的數據(1)。要創立這些客製化療法通常需要使用具有特殊監控功能的生物反應器，這超出了生產通用化合物的典型通用系統。這幾十年來，那些系統使用紫外-可見光光譜技術來監測在混合物內的蛋白質以及其他分子濃度，結果，成為了相對便宜、簡單、值得信賴的方式。

圖一展示了其中一個紫外-可見光系統的例子，使用SR-2XR光譜儀來監測濃度1-100 g/L的牛乳清蛋白以及使用310nm處來做為濃度相關性計算。請注意這戲劇性增強的紫外光響應而可見光和近紅外區域仍保持在非常穩定。

圖一: 使用紫外-可見光光譜儀量測蛋白質濃度。注意這強烈的紫外光響應。

 

這被驗證有效的紫外-可見光方式對許多主流的生產過程是符合要求的，但是更加複雜的合成需要更先進的科技技術。與過去相比，拉曼光譜技術與吸收度/濃度方法相比是非常昂貴的，但是近年來這種狀況開始變化(2)。拉曼光譜一開始的成本相當高，但是普及後讓成本降低，而這又近一步的推動普及。

 

比較紫外-可見光與拉曼光譜在蛋白質分析上

拉曼與普通寬帶光譜不同，它在設定以及採集資料上有著獨特的難點。舉例來說，其中一個要去考慮的是雷射的聚焦距離和功率，以及積分時間、平均和boxcar等的軟體設定(稍後詳細介紹)。在這些之後，使用者最後可能會得到不直觀或不一定連貫的數據趨勢。這聽起來像是花了一堆時間、金錢以及麻煩來產生一些看起來像是噪音的東西。

但事實上，使用拉曼來補足傳統的紫外-可見光分光法是有價值的，不管是濃度確認以及種類鑑定上。讓我們來觀看同樣來自圖一的1-100 g/L蛋白質樣品但是使用QE Pro785nm 拉曼系統來做檢測。

圖二: 使用785m拉曼光譜儀量測蛋白質的拉曼響應。結果有著豐富的細節。

 

這裡有很多東西需要說明(圖二)。也許第一項需要注意的是X軸，這不是顯示波長而是波數，作為785nm參考能階的函數。拉曼的工作原理是量測根據已知的激發能量的飄移(像是你的雷射)，所以單位因此而改變。再來是觀察響應的寬度。我們的紫外-可見光例子只出現在圖表的左側，但是在這裡我們可以看見濃度在各處都有提升。這是因為蛋白質分子天生就比較大團，與有著特定官能基而有著尖銳峰的小有機分子相比，它的發射譜線更寬、更普遍。

寬闊的響應讓我們能夠使用單一波數來做濃度相關性，就像圖表裡使用500 cm-1處(圖二)，或是使用更寬的區域，像是對多個波數做加總。但無論是哪種方式，本質上對濃度的靈敏度都比紫外-可見光的方式低，而且低很多。關於解析度的方程式如下:

對紫外-可見光方式的輸入為吸收單位(AU)，而拉曼則是強度(counts)；而不管是哪種情況，我們希望輸出單位為g/L的蛋白質。如果我們假定紫外-可見光系統有著0.0005AU的標準差，並使用圖一中的校準圖的0.0222AU/(g/L)斜率，我們可以發現該系統有著約0.09g/L的蛋白質解析度，或是約100mg/L。對拉曼系統做同樣的假設，10counts的標準差以及1.7 counts/(g/L)的斜率，就得到12 g/L的解析度或著說比紫外-可見光方式還差兩個數量級的解析度。

所以為什麼要花費超過一萬美金來進行一個差了兩個數量級的全面性檢查呢?複雜的混合物是拉曼系統的亮點，因為對微量小分子的提取決定了昂貴的客製化合成過程的成敗。

 

探索拉曼分析的優勢

 讓我們看看在現實中的案例，自產乙醇梭菌，用在異丙醇的負碳排活動(3)。這種厭氧菌透過大家熟知的途徑來生產乙醇，但是他能進一步用在生產異丙醇和丙酮上。細菌可能會產生這些有機小分子作為廢物，而這有可能會與混合物中的其他成分產生反應，也許會出現意想不到的產物。

在我們來到拉曼部分之前，先讓我們再次使用紫外-可見光方式並且看看放入有機溶劑會對趨勢有什麼影響。我們一直稱這方式為紫外-可見光是因為大多數的蛋白質活動是在較短的波長段，但在這裡使用的擴展波長範圍的Ocean SR型號光譜儀的響應來到1100nm，進入了近紅外區。這個的附加價值很快就變得顯而易見(圖三)。

圖三: 這是加入異丙醇的蛋白質溶液的紫外-可見光吸收響應。

 

注意在近紅外區域內的負吸收率；這不是因為異丙醇的加入，而是因為水的吸收度。在固定的光程中，跟光互相作用的空間有限，隨著酒精濃度提高，水的濃度降低，因此在水的吸收區域內出現負成長。但是也要注意校正圖表依然是線性的，R2值為0.9997；我們仍然可以使用這些數值對IPA濃度校正，前提是我們知道它們是從哪裡來的。這裡就是拉曼分析的切入點。

拉曼量測能告訴你是什麼導致在近紅外的水的吸收度降低，因此你可以很有自信的將紫外-可見光-近紅外吸收數轉換成一些有意義的值。讓我們來看看有跟沒有摻入6.7%體積濃度的異丙醇的蛋白質拉曼掃描(圖四)。

圖四: 加入異丙醇的蛋白質溶液的拉曼響應告訴我們是什麼原因造成在近紅外區域的光譜的水分消失。

這些峰的位置是異丙醇的「指紋」，而且我們也沒有發現其他「指紋」，我們能夠假設我們的近紅外響應是因為異丙醇而不是乙醇、丙酮或其他相似物所引起。現在我們看到互補技術的價值，一種技術能作為另一種技術的槓桿。

優化拉曼分析參數

稍早我們提到積分時間、平均、巴斯卡等的軟體設定。這些對拉曼量測來說可能很棘手，因為這是一個跟時間和峰解析度相關的遊戲。通常來說，在拉曼量測中巴斯卡平均應該要設定非常低，也許一到三但是不高於五，這樣峰就不會被人為消除。也就是說，巴斯卡為零也可能因為單一像素的關係而出現假的峰造成錯誤。主要的權衡取決於積分時間和平均，這兩者都會影響總掃描時間。

在圖五，圖表顯示了幾個不同的積分時間和巴斯卡設定，量測我們的1~100 g/L 蛋白質樣品摻入6.7%體積濃度的異丙醇。

     圖五: 比較拉曼激發譜線的分析可以捕捉到不同的積分時間以及巴斯卡平均揭露出系統量測設定權衡的原因。

主要觀察的點是在較長掃描時間的圖表看起來更平滑以及較少的噪音，幾乎總是如此。耐心是一種美德。但是你不是總有時間，所以對於給定的掃描時間，是要注重在平均上還是積分時間?(有關實踐這些注意事項的應用筆記，請在 oceanoptics.com 上搜尋 Raman Spectroscopy to Monitor UV Curing in Semiconductor Production)

平均通常比積分時間為你做更多的事，因為積分時間只會擴展一切，而平均則會增加有意義的一致性。這在圖五中很難看出，但是請看圖表裡低於1500 cm-¹的峰。你可以看到在333毫秒/3次平均的掃描對比參差不齊的1秒/1次平均的掃描，顯得更加銳利。同樣總掃描時間都是一秒，較低的積分時間以及較高的平均能帶來更理想的輸出。

這為找到由多種有機物組成的更複雜的混合物打下基石，拉曼能給出「有什麼」的資訊，吸收率給出「有多少」的資訊。同時執行這些方式能比只使用一種方式帶給使用者更多在他們的流程中的可視度。

統整紫外-可見光宇拉曼的蛋白質量測

這些是從這次研究中獲得的主要資訊:

•   傳統的紫外-可見光-近紅外光譜吸收方式在濃度校正方面比拉曼方式好。使用拉曼來提供通常的全面檢查或透過獨立方式來驗證這些數字。

•   拉曼的真正價值在於小分子識別(認證)，這能作為認證而回饋給吸收度方式。這種分析在微生物可能產生多種有機物的現代和客製化生物合成過程中變得至關重要。

•   為了在固定時間裡獲得更清晰的拉曼峰，傾向於平均比積分時間來的好。

 

參考

1. Vallely-Gilroy, Caoimhe. Personalized Medicine: The Industry’s Future. International Society for Pharmaceutical Engineering. [Online] ISPE, December 2021. https://ispe.org/pharmaceutical-engineering/november-december-2021/ personalized-medicine-industrys-future. 

2. New advances in using Raman spectroscopy for the characterization of catalysts and catalytic reactions. Hess, Christian. 5, s.l. : Chemical Society Reviews, 2021, Vol. 50. doi.org/10.1039/D0CS01059F. 

3. Clostridium autoethanogenum isopropanol production via native plasmid pCA replicon. Nogle, Robert, et al. s.l. : Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, Vol. 10. doi.org/10.3389/ fbioe.2022.932363.
 

 

文章來源: https://www.oceanoptics.com/wp-content/uploads/2024/05/Getting-Your-Protein-from-Raman.pdf